Fachstelle Bioverfahrens- und Zellkulturtechnik

«Die Fachstelle Bioverfahrens- und Zellkulturtechnik besitzt mehr als 20 Jahre Erfahrung in der Entwicklung biotechnologischer Produktionsprozesse und gehört zu den Pionieren der Single-Use Technologie.»

Prof. Dr. Dieter Eibl, Fachstellenleiter

Kompetenzen, Infrastruktur und Ausstattung

Die Fachstelle, in der die Fachgruppe Bioverfahrenstechnik  und die Fachgruppe Zellkulturtechnik  zusammenarbeiten, beschäftigt sich mit Apparate- sowie Prozessentwicklungen und der Konzeption von modernen biotechnologischen Produktionsstätten. Im Fokus stehen dabei Upstreamprozesse und biotechnologische Produkte für die Pharma-, Kosmetik- und Lebensmittelindustrie. Die Basis bildet ein interdisziplinärer Ansatz, der sowohl bioverfahrenstechnische Aspekte als auch die spezifischen Eigenschaften des verwendeten biologischen Systems berücksichtigt. Als biologische Systeme werden vor allem Insekten-, Säuger- und mesenchymale Stammzellen, aber auch mikrobielle Produzenten (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) und diverse Pflanzenzellkulturen eingesetzt. Die Aktivitäten der Fachstelle umfassen die Bereiche Lehre, Forschung/Dienstleistung und Weiterbildung.

Für experimentelle Arbeiten hat die Fachstelle Bioverfahrens- und Zellkulturtechnik, die integraler Bestandteil des Institutes für Chemie und Biotechnologie (ICBT) der Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW) ist, eine umfangreiche, technische Ausstattung für die Charakterisierung von Apparaten (z.B. PIV-Anlage) und die Kultivierung (Schüttler, Inkubatoren, Mischer, Lager- und Vorlagetanks, gerührte, geschüttelte und wellendurchmischte Bioreaktoren bis 200 L Arbeitsvolumen) zur Verfügung. Hier ist vor allem unsere Ausstattung mit moderner Einwegkultivierungstechnologie hervorzuheben. Darüber hinaus sind auch Apparaturen zur Produktaufarbeitung (Fest-Flüssig Trennung, Zellaufschluss, Chromatographie) vorhanden. Der Analytikbereich (automatisierte Zellzählgeräte, automatisierte Geräte zum Monitoring von Substraten, Metaboliten und protein-basierten Produkten, FACS-System) erlaubt die Erfassung aller notwendigen off-line Daten für die Prozessbewertung. Zusätzlich kann bei Bedarf auf Geräte zur Spezialanalytik wie HPLC- und MS-Geräte des Institutes für Chemie und Biotechnologie (ICBT) und das Fachwissen der dort angesiedelten Spezialistinnen und Spezialisten zurückgegriffen werden.

Kooperationen der Fachstelle bestehen zu anderen Fachbereichen (z.B. Zell- und Molekularbiologie, Sensortechnologie) innerhalb des IBT sowie der ZHAW, aber auch die ZHAW und die Landesgrenzen hinaus. Ausserdem  bestehen langjährige Zusammenarbeiten mit Partnern aus der Industrie.

Beispiel Projekte

KTI-Projekt 12893.1 VOUCH-LS: Entwicklung einer Technologieplattform für die skalierbare Produktion von therapeutisch relevanten Stammzellen

Screening-Untersuchungen (Corning Spinner)
UniVessel SU 2L (Sartorius Stedim)
BIOSTAT STR 50L (Sartorius Stedim)

Im Fokus dieses KTI-Projektes stand die Entwicklung eines neuen Konzepts zur Produktion von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe (hASCs) und dem Knochenmark (hBM-MSCs) für den zelltherapeutischen Bedarf. Hierzu sollte eine innovative, Technologieplattform konzipiert werden, welche im Gegensatz zu Standardverfahren in planaren Systemen eine automatisierte und skalierbare Massenproduktion bei reproduzierbarer Zellqualität ermöglicht. Aus diesem Grund wurde im Rahmen des KTI-Projektes ein Microcarrier (MC)-basiertes Kultivierungsverfahren unter der Verwendung von gerührten Einwegreaktoren entwickelt, welches es erlaubt hASCs und hBM-MSCS in 100mL, 2L (Benchtop-Massstab) und 50L Arbeitsvolumen (Pilot-Massstab) zu produzieren. Im ersten Projektschritt wurde in Einwegspinnerflaschen (Corning, 100 mL) ein ausführliches Screening mit mehr als 100 Konditionen durchgeführt. Hierbei wurde pro Zelltyp eine geeignete Kombination aus Medium und MC ermittelt, welche es ermöglicht die Zellen unter serumreduzierten Bedingungen effizient zu expandieren (maximale Expansionsfaktoren von 40-60 in 6 Tagen).

Anschliessend wurden mit Hilfe von numerischen Strömungssimulationen (CFD) das Strömungsfeld und die MC-Verteilung im Spinner untersucht, und die Ergebnisse mit PIV-Untersuchungen validiert. Dadurch konnten Regionen bestimmt werden, bei denen sich die MC vorzugsweise absetzten, wobei es zu Limitationen (Nährstoff, Sauerstoff) für die Zellen kommt. Aus diesem Grund wurden Suspendierkriterien (NS1u und Ns1) als Scale-up Kriterien für die Massstabsübertragung definiert, welche ein ausreichendes Suspendieren der MC mit den Zellen gewährleisteten. Auf Basis dieser Kriterien konnten mittels CFD die mechanischen Belastungen sowie der spezifische Leistungseintrag bestimmt werden. Unter Einbezug von Kultivierungen mit unterschiedlichen Rührerdrehzahlen wurde so die maximale, tolerierbare Scherbelastung (0.004- 0.2 Nm-2) für die hADSCs und hBM-MSCs im Einwegspinner ermittelt. Während der Scale-up Untersuchungen im UniVessel SU 2L (Sartorius Stedim) wurde festgestellt, dass unter Einhaltung der Suspendierkriterien eine zu hohe Scherbelastung entsteht, welche das Zellwachstum beeinträchtigt. Deshalb wurde mit Hilfe von CFD-Simulationen ein UniVessel SU 2L mit modifiziertem Rührer entwickelt, der gegenüber der Standardvariante ein optimiertes Strömungsfeld aufweist, so dass schon bei 82% niedrigeren Rührerdrehzahlen die Suspendierkriterien erfüllt werden. Auf Basis der Spinner-Kultivierungen, Suspendierkriterien und der CFD-Untersuchungen konnten sowohl im modifizierten UniVessel SU 2L als auch im Standard BIOSTAT STR 50L beide Stammzelltypen erfolgreich kultiviert werden. Durch weiter Prozessoptimierungen (MC-Menge, Inokulum-Produktion, Feed-Strategie, Zellernte) gelang es, die Zellausbeuten (modifizierter UniVessel SU 2L, 1· 109 Zellen; BIOSTAT STR 50L, 3.6· 1010 Zellen) zu erhöhen. Dabei war das Zellwachstum (0.3-0.35 h-1) dem der Spinnerkultivierungen vergleichbar. Mit FACS-Analysen wurde nachgewiesen, dass die kultivierten MSCs nicht differenzieren und ihre Stammzelleigenschaften beibehalten.

KTI-Projekt 13236.1 PFFLI-LS: Entwicklung einer magnetgelagerten Single-Use Zentrifugalpumpe für biopharmazeutische Applikationen

PuraLev 200SU (Levitronix)
CFD-Modellierung der PuraLev 200 SU
PuraLev 600 SU (Levitronix)
PuraLev 2000 SU (Levitronix)

Im Fokus des KTI-Projektes stand die Qualifizierung und Weiterentwicklung von magnetgelagerten Single-Use-Zentrifugalpumpen für biopharmazeutische Applikationen mit schersensitiven Fluiden. Als schersensitive Fluide wurden CHO-Suspensionszellen (chemisch definiertes Kulturmedium), Proteinlösungen und eine Modellemulsion ausgewählt, um die mechanische Beanspruchung durch die Prototypen der Single-Use-Pumpen (PuraLev® 200SU/600SU/2000SU) der Firma Levitronix® zu ermitteln. Zur Bestimmung ihrer mechanischen Beanspruchung wurden zusätzlich numerische Strömungssimulationen (CFD) realisiert. Darüber hinaus fanden Vergleichsuntersuchungen mit den Multi-Use-Zentrifugalpumpen (PuraLev® 200MU/600MU) von Levitronix® sowie einer Schlauchquetschpumpe und einer 4-Kolbenmembranpumpe von Konkurrenzanbietern statt, die eine Bewertung der experimentellen und simulierten Resultate der Single-Use-Pumpen erlaubten.

Die Daten der pumpenspezifischen Absterberaten der CHO-Zellen, die bei Volumenströmen von 3.4 L min-1 und 10 L min-1 und Drücken von 0.03, 0.30, 0.50 und 0.61 bar aufgenommen wurden, lassen den Schluss zu, dass die mechanische Beanspruchung durch alle PuraLev®-Pumpen gering ist. Durch die Optimierung des Pumpenkopfdesigns und der Oberflächenrauigkeit konnte für die modifizierten Single-Use-Varianten PuraLev® 200SU und 600SU sogar ein bis zu 41% beanspruchungsärmeres Verhalten erreicht werden. Bei den Untersuchungen mit den Proteinlösungen (Lysozym) wurden weder Veränderungen der Aktivität (photometrische Messung) noch der Struktur (Streulichtmessung, Grössenausschluss-Chromatographie) durch die PuraLev®-Pumpen nachgewiesen. Hingegen wurde bei der untersuchten Schlauchquetschpumpe ein leichter Aktivitätsverlust und bei der getesteten 4-Kolbenmembranpumpe sogar eine Lysozyminaktivierung festgestellt. Der tiefere Scherstress der PuraLev®-Pumpen konnte auch durch die Bestimmung des Tropfenaufbruches (Sauterdurchmesser) in Abhängigkeit der Energiedissipationsrate gezeigt werden. Dazu wurden das Emulsionsmodell, die Inline-Endoskopie der Firma SOPAT GmbH und CFD erstmals kombiniert. Für die weiterentwickelten Single-Use-Pumpen PuraLev® 200SU und 600SU ergaben sich im Vergleich zu den anderen Pumpen wesentlich geringere mechanische Beanspruchungen. Die Projektresultate erlauben der Firma Levitronix® interessierte Kunden für schersensitive Single-Use-Pumpen bereits nach Projektabschluss mit Vorserienmustern der PuraLev® 200SU und 600SU zu beliefern.

 

 

EU project 222716: SmartCell

Hairy roots
Hairy roots
Hairy roots nach Kultivierung in einem wellendurchmischten System

«SmartCell focused on metabolic engineering using plants and plant cell-based systems to produce key terpenoids. In turn this required the in-depth analysis of the corresponding pathway in terms of the genes, enzymes and intermediates, and the complex regulatory processes including transcriptional and translational control, the regulation of mRNA and protein turnover, the regulation of enzyme activity, and the compartmentalization of enzymes and intermediates. The main goal of the project was therefore to develop fundamental knowledge and enabling technologies to facilitate the rational engineering of plants and plant cells and the production of target secondary metabolites.

The engineering strategy was divided into two phases: a fast track leading to 8-hydroxygeraniol and an advanced track leading to secologanin. Deep sequencing of the Catharanthus roseus transcriptome along with comparative proteomics and metabolomics was used for the identification and functional analysis of candidate genes. This resulted in the unravelling of all remaining unknown enzyme-encoding genes up to secologanin as well as several regulatory and transporter genes with roles in the terpenoid biosynthesis pathway and genes encoding terpenoid-decorating enzymes. A set of 15 selected enzymes (out of more than 60 screened ones) was expressed in yeast and E. coli and transiently in Nicotiana benthamiana and screened for activity against putative substrates, validating the complete pathway. Multigene transformation methods were developed to introduce the corresponding genes stably into tobacco in order to reconstruct the early part of the terpenoid pathway in plants, hairy roots and cell lines.

Several analytical platforms were developed to profile the terpenoid content of these platforms using a combination of chromatography (UPLC-MS, GC-MS), NMR spectroscopy and flux analysis. The data formats and data processing methods were standardized for consistent handling of the large datasets and an experimental data respository was established. New bioinformatics tools were developed so that spectral differences between groups of tobacco and C. roseus samples with different genotypes and growth conditions could be measured, characterised and validated.

SmartCell also made the initial steps towards the large-scale production of plants in the greenhouse and cultured plant cells and hairy roots in bioreactors by evaluating novel disposable systems and developed cryopreservation techniques for the most important cell lines. We determined that hairy root and cell suspension cultures provided the highest yields of geraniol (the proof-of-concept target compound in the demonstration activities) and established that the optimised systems and procedures could be used to manufacture » 1 g of geraniol in 41 days.

These results from the SmartCell project will help to facilitate further research related to secondary metabolism, reduce the costs associated with the large-scale production of valuable pharmaceutical and industrial molecules and finally ensure that pharmaceuticals using plant-based systems are produced to the highest possible regulatory standards.»

Source: Excerpt from the final project Report
Project website address: http://www.smart-cell.org
Remark: Our team was involved in the cell culture-based process development and process scale-up. 

Mitarbeitende

Bioverfahrenstechnik

Prof. Dr. Dieter Eibl

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 57 11
dieter.eibl@zhaw.ch

Dr. Iris Poggendorf

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 56 64
iris.poggendorf@zhaw.ch

Valentin Jossen

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 53 34
valentin.jossen@zhaw.ch

Senad Lisica

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 57 76
senad.lisica@zhaw.ch

Rüdiger Maschke

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 54 83
ruediger.maschke@zhaw.ch

Sandra Jäggi

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

sandra.jaeggi@zhaw.ch

Mischa Stalder

ZHAW Life Sciences und Facility Management

+41 (0) 58 934 56 78
mischa.stalder@zhaw.ch

Cedric Schirmer

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 54 64
cedric.schirmer@zhaw.ch

Zellkulturtechnik

Prof. Dr. Regine Eibl-Schindler

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 57 13
regine.eibl@zhaw.ch

Sören Werner

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 57 80
soeren.werner@zhaw.ch

Ina Dittler

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 54 57
ina.dittler@zhaw.ch

Katharina Blaschczok

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 54 05
katharina.blaschczok@zhaw.ch

Irène Kathrin Stutz

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 57 55
irene.stutz1@zhaw.ch

Lidija Lisica

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 57 60
lidija.lisica@zhaw.ch

Philipp Meier

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

philipp.meier@zhaw.ch

Renate Lombriser

ZHAW Life Sciences und Facility Management
Grüental
8820 Wädenswil

+41 (0) 58 934 53 85
renate.lombriser@zhaw.ch